PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)
Amplification des acides nucléiques

PCR RT-PCR PCR en temps réel Et leurs applications

La PCR : une révolution technologique en biologie moléculaireAPPLICATIONS : – Médecine légale * Identification d’un suspect
* Recherche de paternité

– Détection de microorganismes pathogènes (à ADN ou à ARN) – Diagnostics préimplantatoire et prénatal – Etude del’expression des gènes – Détection de mutations – Agroalimentaire (OGM)

Etude d’un cycle de PCR

1. Dénaturation de l’ADN cible 2. Hybridation des amorces 3. Extension des amorces

– Ces 3 étapesse font à des températures différentes. – La PCR consiste à répéter ce cycle de 3 étapes thermiques dans un même tube.

Les 2 brins de l’ADN sont maintenus appariés par des liaisons non covalentes: G?C et A=T. La dénaturation correspond à la rupture de ces liaisons par la température (94°C) ? ADN simple brin

En se plaçant dans les conditions de renaturation de l’ADN (?55°C), les séquencescomplémentaires se réapparient. Les oligonucléotides spécifiques (20 bases) à une molarité 106 fois celle de la cible s’hybrident sur l’ADN.

Les oligonucléotides servent d’amorce à une ADNpolymérase qui recopie chacun des brins initiaux en incorporant les dNTPs. Le brin néosynthétisé s’étend de 5’?3’ et est complémentaire de la cible.

La succession des cycles

A chaque cycle : doublementdu nombre de copies de la séquence cible. En PCR classique : 25 à 40 cycles sont effectués ?225 à 240 copies (théoriques) 230 = 1 073 741 824

Réalité de l’amplification

Visualisation del’amplification
Après coloration des acides nucléiques par un agent intercalant (BET ou bromure d’éthidium)

Le milieu réactionnel :
– La matrice (cible) – L’enzyme – Les oligonucléotides (5’ et 3’) -dNTP – MgCl2 – Autres

L’ADN cible

– Pas forcément purifié (lysat de cellules) – Pas en trop fort quantité : 10 ng dans 50 (inhibition de l’amplification ou smear) l

– Pas trop de…